Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN
Suların Mikrobiyolojik Analizlerinde “Yok” Ne Demektir?
Özellikle gıda ve çevre numunelerindeki mikrobiyolojik analizler farklı amaçlarla yapılır. Kiminde belirli grupların (koliform grup, sporlu bakteriler, toplam maya-küf vb. gibi) sayısı hedef alınırken, genellikle E. coli gibi fekal indikatörlerde ve Salmonella’da olduğu gibi patojenlerde hedef bakterinin sayısı önemli değildir, belirli bir miktardaki numunede olmaması istenir. Bunlar; var/ yok testleri ile yapılan analiz yöntemleridir.
Sayım yapıldığında çok genel olarak sonuçlar 1 g ya da 1 mL örnekte verilirken, membran filtrasyonla yapılan su analizlerinde sonuçlar çoğu kere 100 mL su numunesinde verilir.
Var/ yok testlerinde genellikle 25 g ya da 25 mL numune analiz edilir. Çoğu ulusal standarda göre 100 mL içme/ kullanma suyunda E. coli bulunmaması istenir. Membran filtrasyonla yapılan analizlerde 100 mL su numunesi geçirilmiş membran filtre, uygun bir besiyerine yerleştirilip inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonunda hedeflenen sonuç besiyerinde 0 sayıda E. coli olmasıdır. 1 ya da daha fazla sayıda E. coli olması o numunenin reddi anlamına gelir.
Standart var/ yok analizlerine göre burada bir farklılık vardır. Bu yöntemde E. coli sayımı mümkündür. Her ne kadar E. coli sayısı standartlara göre bir şey ifade etmiyorsa da (0 sayıda olmadığına göre numune reddedilmiştir), örneğin işletmeci açısından bu değer bir şey ifade edebilir.
Yine gıda ve çevre numunelerindeki patojenlerin analizinde genellikle selektif olmayan ön zenginleştirme, selektif zenginleştirme, selektif katı besiyerine sürme, izolasyon ve doğrulama aşamalarından geçer. Sonuçta aranan patojen bulunursa, başlangıçta kaç adet olduğu hiçbir şekilde belirlenemez çünkü zenginleştirme aşamalarından geçmiştir.
Var/ yok analizlerinde selektif olmayan ön zenginleştirme aşamasının uygulanmasındaki temel neden, hedef mikroorganizmanın hasar görmüş olma olasılığıdır. Hasar görmüş olan mikroorganizmalar, doğrudan selektif besiyerine ekilirlerse, burada gelişip koloni yapamayabilirler. Bu özellik, mikroorganizmadaki hasarın durumu ve besiyerinin selektivitesi ile doğrudan ilgilidir.
Selektif besiyerleri; çeşitli antibiyotikler, kimyasallar vb. gibi hedef mikroorganizma dışındaki refakatçi florayı en fazla düzeyde baskılarken, hedef mikroorganizmaya minimum düzeyde zarar verecek, onun gelişmesini engellemeyecek maddeler içerirler. Ancak bu maddelerin özellikle konsantrasyonları, hedef mikroorganizmanın yeterli bir aktiviteye sahip iken ona zarar vermeyeceği düzeydedir. Dolayısı ile özellikle selektif olmayan ön zenginleştirme ile hedef mikroorganizmaya bu yeterli aktivite kazandırılır.
Hafifçe klorlanmış ya da olumsuz çevresel koşullara maruz kalmış bir su numunesinde hasar görmüş E. coli hücreleri kaldığını varsayalım. Membran filtrasyon uygulaması sonunda çok selektif bir besiyeri kullanılırsa, sonucun 0/100 mL olarak elde edilmesi olasıdır. Selektivitesi düşük bir besiyeri kullanılırsa, hasar görmüş bu hücrelerin besiyerinde gelişerek koloni oluşturması beklenebilir ancak bu kez de refakatçi floranın aşırı gelişmesine bağlı olarak besiyerinde E. coli kolonisinin fark edilmeme olasılığı vardır. Bu koşulda da yine sonuç hatalı olarak 0/100 mL olarak verilir.
100 mL su geçirilmiş membran filtrenin doğrudan 20-30 mL kadar Tryptic Soy Broth gibi genel bir sıvı besiyerine bırakılıp, 37 oC’da 6-8 saat inkübasyon sonunda hasar görmüş hücreler ciddi şekilde kendilerini toplarlar. Bu amaçla Tamponlanmış Peptonlu Su gibi yine genel bir besiyerinde 37 oC’da 18-24 saat inkübasyon sonunda artık tüm hasarlı E. coli hücreleri, hasarı onarmışlar ve aktif hâle geçmişlerdir. Bu kültürden selektif agarlı bir besiyerine sürme yapılması sonunda sonuç “var/ 100 mL” olarak verilir.
Aynı 100 mL su numunesinin, 100 mL çift kuvvette hazırlanmış Tryptic Soy Broth gibi genel bir sıvı besiyerine ilave edilip, 37 oC’da 6-8 saat inkübasyon sonunda toplam 200 mL olan sıvının (besiyeri+su numunesi) tümünün membran filtreden geçirilip, filtrenin selektif bir besiyerine yerleştirilip, standart inkübasyonu sonunda E. coli kolonilerinin elde edilme olasılığı, 100 mL suyun doğrudan membran filtreden geçirilip, filtrenin selektif bir besiyerine yerleştirilip, standart inkübasyonu sonunda E. coli kolonilerinin elde edilme olasılığına göre çok yüksektir.
Görüldüğü gibi aynı su numunesinde başlangıç membran filtrasyon olmakla birlikte devamında kullanılan besiyerinin selektivitesi ve filtrenin ön zenginleştirme besiyerine bırakılıp inkübe edilmesi ile başlangıçta basit bir ön zenginleştirme ve arkasından membran filtrasyon uygulaması sonunda farklı var/ yok sonuçları alınabilmektedir.
Var/ yok analizlerinde hedef mikroorganizma “var” olarak bulunursa laboratuvar açısından tatmin edici sonuç alınmıştır. Her ne kadar E. coli, Salmonella vb. gibi istenmeyen bakterilerin bulunması, çalışılan numune açısından olumsuz bir durum ise de bir sorun vardır, gereken yapılır. Ancak yukarıda verilen örneklerde olduğu gibi hatalı olarak negatif (yok) sonuç alınırsa, laboratuvar “gerçekten mi yok” endişesine kapılabilir.
Su numunesinin önceden genel bir sıvı besiyerine ilave edilip, ön zenginleştirme sonrası membran filtrasyon ya da standart uygulamadan sonra membran filtrenin sıvı besiyerinde inkübasyona bırakılması gibi uygulamaların standart analizlerde yeri yoktur. Rutin analizlerin nasıl yapılacağı, sonucun nasıl değerlendirileceği standartlarda açık bir şekilde tanımlanmıştır.
Bu gibi uygulamalar ancak şüpheli durumlarda uygulanacak yöntemlerdir.